Una piattaforma di microarray versatile per l'acquisizione di cellule rare

Jul 31, 2023

Scientific Reports volume 5, numero articolo: 15342 (2015) Citare questo articolo

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Le analisi di eventi rari che si verificano a frequenze estremamente basse nei fluidi corporei sono ancora impegnative. Abbiamo creato una piattaforma versatile basata su microarray in grado di catturare singole cellule bersaglio da ampie popolazioni di fondo. Come caso d’uso abbiamo scelto l’impegnativa applicazione del rilevamento delle cellule tumorali circolanti (CTC), ovvero circa una cellula su un miliardo di cellule del sangue normali. Dopo l'incubazione con un cocktail di anticorpi, le cellule mirate vengono estratte su un microarray in un chip microfluidico. L'accessibilità della nostra piattaforma consente il successivo recupero degli obiettivi per ulteriori analisi. Il microarray facilita l'esclusione di eventi di cattura di falsi positivi mediante co-localizzazione consentendo il rilevamento senza etichettatura fluorescente. L'analisi dei campioni di sangue di pazienti affetti da cancro con la nostra piattaforma ha raggiunto e in parte superato le prestazioni dello standard di riferimento, dimostrando la fattibilità per l'applicazione clinica. La libera scelta del cocktail di anticorpi da parte dei ricercatori clinici, senza la necessità di alterare la produzione di chip o il protocollo di incubazione, consente il targeting virtuale arbitrario delle specie di cattura e quindi applicazioni diffuse nelle scienze biomediche.

Il rilevamento e la caratterizzazione molecolare di sottoinsiemi specifici di singole cellule presenti a frequenze estremamente basse nei fluidi corporei ha un potenziale importante in biomedicina come strumento diagnostico, ma è tecnicamente ancora molto impegnativo nonostante gli enormi sforzi compiuti negli ultimi dieci anni. Fluidi come sangue, urina, liquido pleurico, liquido cerebrospinale o ascite svolgono un ruolo centrale nella diagnostica medica e il sangue è la fonte di informazioni più utilizzata. Oltre all'analisi di molecole di derivazione cellulare (ad es. proteine, acidi nucleici e metaboliti), l'analisi di cellule intere circolanti nel sangue può rivelare informazioni molto complesse sulla causa e sullo stato attuale di una specifica malattia a livello del DNA, dell'RNA e delle proteine. livello. Esempi di applicazioni nella ricerca di base e applicata sono l'analisi di rari sottogruppi di cellule T nel sangue periferico di pazienti con disturbi immunitari o malattie infettive1 nonché di cellule tumorali circolanti (CTC) in pazienti affetti da cancro, che può essere considerata una "biopsia liquida" ”2,3, un nuovo concetto diagnostico4 che ha riscosso un enorme interesse negli ultimi cinque anni5,6,7,8. Le metastasi a distanza rappresentano la principale causa di morte correlata al cancro9 e iniziano con il rilascio di cellule tumorali dal tumore primario solido (ad esempio, cancro al seno) nel flusso sanguigno10,11. Queste CTC possono depositarsi in organi distanti (p. es., polmone, fegato, ossa o cervello) e infine formare lesioni metastatiche. L'analisi delle CTC offre importanti spunti sulla biologia della progressione metastatica e nuove prospettive nel trattamento delle metastasi tumorali12,13. Tuttavia, l'arricchimento e l'identificazione delle CTC da un campione di sangue rappresentano ancora una sfida importante, anche dopo decenni di ricerca, poiché il rapporto tra CTC e cellule del sangue è di circa 1:109 (assumendo < 200 CTC/ml, 5 × 109 RBC/ ml, 7 × 106 globuli bianchi/ml)14. Molte diverse strategie di arricchimento per le CTC si basano su una selezione positiva mirata alla molecola di adesione delle cellule epiteliali (EpCAM) e sono stati sviluppati vari approcci microfluidici che mostrano risultati promettenti15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. Le superfici rivestite anti-EpCAM interagiscono con le molecole EpCAM nella membrana cellulare che immobilizzano le CTC, mentre le cellule del sangue trasmettono il sistema. La verifica e l'ulteriore analisi delle cellule catturate vengono effettuate mediante immunocolorazione o altri approcci5. Tuttavia, studi recenti hanno dimostrato che EpCAM non è sempre un marcatore affidabile poiché anche CTC EpCAM-negative sono state scoperte nel sangue di pazienti affetti da cancro25,26,27. Gli approcci basati su superfici rivestite di anticorpi omogenei lottano con una bassa specificità, rendendoli potenzialmente inefficaci per le applicazioni pratiche. Per questo motivo, lo sviluppo di dispositivi di cattura delle CTC che (i) possano facilmente colpire un'ampia gamma di diversi epitopi di superficie, (ii) siano in grado di gestire elevati volumi di sangue, (iii) presentino un'elevata specificità e (iv) consentano un singolo l’analisi cellulare è ancora impegnativa, ma molto richiesta.